CCS, mastite e metodologias de análise

Por Emiliano A. Veiga; Revisão: 1.4.28

O artigo apresenta um breve e objetivo resumo sobre CCS, mastite e algumas metodologias para contagem de células somáticas.

O que são células somáticas?

As células somáticas são o conjunto de células de defesa e células do tecido epitelial da glândula mamária, naturalmente presentes no leite [1] [2]. As células epiteliais têm origem na descamação normal do tecido de revestimento da glândula mamária.

Quanto à proporção dos tipos de células, alguns estudos apresentam que cerca de 25% do total de células somáticas são de origem epitelial e 75% são leucócitos [3] [4] [5]. Já outro estudo traz que em animais sadios, a proporção de células epiteliais está entre 65% a 80% do total de células, e que esse número cai para 50% em animais com mastite crônica e pode alcançar proporções ainda menores em casos mais graves [6].

A contagem de células somáticas no leite pode variar conforme a presença, o tipo e a gravidade do patógeno [7]. A CCS também sofre variação por outros fatores, tais como idade, estágio da lactação, número de partos, nível de produção, estresse, variação ao longo do dia, fatores ambientais e ainda sistema de ordenha [8] [9].

Qualidade, composição e mastite

A mastite é um dos problemas mais comuns em vacas leiteiras e que produz grandes perdas econômicas no segmento lácteo [10] [11] [12] [13]. Avaliações com amostras de leite pasteurizadas que apresentavam CCS próxima de 849 (x 1000 cels/ml) após quadro infeccioso, tiveram vida de prateleira reduzida, além de baixas classificações gerais de qualidade nos testes sensoriais [14]. 

Em outro estudo, onde foram analisadas quase 2 milhões de amostras de leite, os pesquisadores encontraram forte correlação entre a redução da lactose com o aumento do escore de células somáticas, incluindo também a redução de caseína [16]. Quando há redução da concentração de lactose do leite em razão da ocorrência de mastite, ocorre um aumento compensatório da concentração de minerais solúveis no leite (Na e Cl) [15]. E a redução de lactose pode interferir na leitura do teste de crioscopia. Na produção de queijos, por exemplo, existe uma relação do rendimento com a composição do leite e a incorporação dos sólidos pela coagulação, especialmente os teores de proteína e gordura [17].

Monitorar e identificar casos de mastite é uma demanda constante no setor lácteo, tanto por parte de produtores quanto indústrias do setor. Para o produtor, os impactos vão desde custos com tratamento, descarte de leite, descarte de animais e até redução no valor recebido pelo litro produzido. Na indústria, pode haver perda de rendimento de produção, redução de vida de prateleira, dentre outros.

É neste sentido que diversas metodologias foram e vêm sendo aplicadas com a finalidade de caracterizar a presença e o grau de mastite em rebanhos leiteiros. Desde avaliação individual até as análises de tanque. Quanto mais rápido obter a informação, maiores são as chances de tratamento, obtenção de bons resultados em qualidade e economia financeira, além de promover melhor bem-estar animal.

A determinação da contagem de células somáticas em leite bovino cru pode ser realizada por métodos diretos ou indiretos. Tradicionalmente, a contagem de células somáticas no leite bovino é utilizada como indicativo da qualidade do leite, para controle da mastite e, indiretamente como sinalização da higiene do leite [18].

O dinamismo da CCS

A contagem de células somáticas pode sofrer variação diária. Durante a ordenha e em função do método de coleta. A CCS é menor imediatamente antes do início e maior nas porções finais da ordenha, e essa diferença pode variar de 4 a 70 vezes [19]. As amostras coletadas na ordenha da tarde podem ter CCS maior do que na ordenha da manhã, o que significa que as amostras compostas devem ser obtidas a partir do leite das duas ordenhas (manhã e tarde). 

Após a ordenha, a CCS pode permanecer elevada por até 4 horas até que vai baixando gradualmente. Essa variação diária da CCS pode ser explicada pelas flutuações na produção, eliminação espontânea de infecções, estresse e até mesmo por variação fisiológica normal [4] [19]. Além do mais, a vaca é um ser vivo biologicamente complexo e dinâmico. Estima-se que cerca de 600 litros de sangue passem pela região do úbere para produzir 1 L de leite [15].

Metodologias de análise

Contagem microscópica

A contagem por microscopia direta é considerada o método oficial e de referência para a contagem de células somáticas em leite cru.  A técnica baseia-se na contagem de células ou núcleos após a coloração, utilizando um microscópio óptico ou de fluorescência. O primeiro procedimento microscópico para contagem direta de células especificava 0,01 mL de leite por uma área de 1 cm² e utilizava o corante verde de metil e pironina-Y [20] [21]. O corante adere ao DNA das células, permitindo identificar até mesmo o tipo de célula por meio de um microscópio [22].

Ao longo dos anos o método evoluiu e a operação tornou-se mais simplificada, inclusive com a utilização de outras famílias de corantes, como o metileno azul [23] [24], a coloração com May Grunwald-Giemsa, onde na avaliação prática, evidenciou melhor a morfologia celular e a distinção de cores entre polimorfonucleares e mononucleares [25] (Figura 1). Outro estudo usando a coloração com brometo de etídio também demonstrou boa penetração no DNA de células com degradação da parede celular e também de células mortas [26].

Figura 1 – Avaliação da contagem de células somáticas corado com coloração May Grunwald-Giemsa. Linfócitos (A), neutrófilos (B) e células epiteliais de descamação (C). Fonte: (Viana, K. F., et al, 2010) [25].

Embora este seja o método considerando referência, existe também um consenso quanto a sua limitação de aplicação em escala, tempo, infraestrutura e outras dificuldades, como obter medidas precisas de um volume de leite na ordem de 0,01 mL e também do preparo das soluções de coloração, exigindo pessoal altamente treinado [27]. Para o processo de contagem, já existem microscópios de fluorescência que efetuam a captação da imagem e um software efetua a contagem de modo automatizado, assegurando maior acurácia nesta parte do processo [26].

O desenvolvimento ou aplicação de outras metodologias para contagem de células somáticas, deve ter sua calibração baseada na contagem microscópica, descrita na ISO 13366-1.

Citometria de fluxo

A citometria de fluxo é uma técnica de contagem de células e partículas utilizada em analisadores fluo-opto-eletrônicos. É uma tecnologia de ampla aplicação que analisa células e partículas enquanto fluem através de uma câmara de fluxo muito estreita (funil) [28]. A citometria de fluxo surgiu como uma necessidade de automatização de análises realizadas com microscópio óptico e de fluorescência por diversos segmentos desde a medicina, biologia, química, engenharia e botânica. Sua história começa na década de 1930 e no Brasil, em 1988, chegou o primeiro citômetro de fluxo no Instituto Oswald Cruz, FIOCRUZ [29].

Basicamente, as amostras a serem analisadas seguem um protocolo de preparo que envolve a utilização de uma substância de coloração, ou também conhecida por marcador.

A amostra então é diluída numa solução, sendo aspirada por um sistema de sucção até uma câmara de fluxo onde recebe uma irradiação laser de comprimento de onda específico, por exemplo ultravioleta (355 nm); violeta-azul (405 nm), hélio-neônio (633 nm) ou argônio (488 nm) [29]. Tal comprimento de onda vai produzir um efeito de excitação nos elementos onde estão aderidos o reagente colorimétrico. Um sistema optoeletrônico vai medir as variações de potência de luz absorvidas ou refletidas pelos elementos biológicos, convertendo a contagem de células por meio de um software de computador, que aplica uma calibração conforme o tipo de elemento biológico analisado.

Figura 2 – Ilustração do processo de contagem de células e partículas pelo método de citometria de fluxo. Fonte: Adaptado de (Abcam, 2020).

Na análise do leite de vaca para contagem de células somáticas utilizando o citômetro de fluxo, as amostras devem estar aquecidas a cerca de 40 °C e então 3 mL de leite são sugados para o interior do equipamento, misturando-se com o corante brometo de etídio para a contagem de células somáticas [30]. A Figura 3 abaixo ilustra o processo.

Figura 3 – Contagem automática de células somáticas. Aparelho Somacount 300 ® (A). Amostras de leite em banho-maria a 40°C por 15 minutos (B). Primeira fase de análise onde a agulha de sucção aspira 3mL de leite para limpeza do equipamento (C). Segunda fase de análise onde a agulha de sucção aspira mais 3 mL de leite misturando-se com o corante brometo de etídeo para a contagem de células somáticas (D). Fonte: (Machado, G., 2013) [30].

O método por citometria é uma aproximação da contagem microscópica. Sua aplicação para contagem de células somáticas  no leite está descrita na Norma ISO 13366-2. Dentre os principais requisitos descritos na norma, orienta a manutenção da calibração do sistema em ciclo mensal e deve atender a faixa de 100.000 cels/mL até 2.000.000 cels/mL na análise individual e de 100.000 cels/mL até 1.000.000 cels/mL para tanques. A referência de calibração deve ser usando a contagem microscópica, descrita na ISO 13366-1.

Requer conservação da amostra em temperaturas abaixo de 6°C para leite sem conservante com análise em até 96h e em até 12°C para leite com o conservante Bronopol com análise em até 6 dias. É descrito ainda que não devem ser utilizadas substâncias que possam interferir na contagem, como o metileno azul em concentrações acima de 0,06 mg/100 mL.

A norma especifica que, para raças com alta gordura e proteína, uma possível interferência nos resultados deve ser verificada. Descreve ainda que a análise de amostras após congelamento e descongelamento podem resultar em contagens de 10% a 20% menores.

A norma ainda destaca que a homogeneização da amostra é essencial, pois as células somáticas podem se concentrar nas camadas superiores e inferiores no caso de homogeneização insuficiente e o rompimento de células somáticas resulta em um aumento de fragmentos, reduzindo a intensidade da fluorescência, consequentemente produzindo baixas contagens.

CMT - Califórnia Mastitis Test

O CMT ou Califórnia Mastite Teste é um método muito empregado para identificar vacas com mastite subclínica na fazenda. Necessita de uma raquete contendo quatro cavidades e o reagente do CMT. Mistura-se o leite com o reagente, homogeneíza-se e faz a leitura após 10 segundos.

Conforme a quantidade de células somáticas no leite, forma-se um gel, modificando a viscosidade da solução. Se a quantidade de células é baixa, não formando gel, então o resultado é negativo [31].

A tabela 1 apresenta uma relação entre o escore de mastite e a estimativa de CCS.

CCS (x1000 cels/ml)

Aparência da solução

Escore CMT

Abaixo de 200

Sem alteração

Negativo

150 a 500

Alteração suave ao movimentar a raquete

Traços

400 a 1500

Alteração leve, mas sem formação de gel

+

800 a 5000

Formação de gel

++

Acima de 5000

Forte geleificação da amostra. Tendência de aderir a raquete.

+++

Fonte: Adaptado de Department of Food Science and Nutrition | University of Mussouri [32].

É um dos mais simples testes que podem ser aplicados para detecção de mastite. É qualitativo, com a contagem indireta e o resultado sinaliza em que faixa de CCS pode estar a amostra testada. É um teste de baixo custo disponível no mercado desde 1957 [33]. Indicado para o monitoramento do grau de infecção nos quartos mamários, embora a interpretação do resultado para contagens abaixo de 500.000 cels/mL possa ser um desafio no início, mas que pode ser desenvolvida uma sensibilidade com o passar do tempo. Além do mais, o tempo de verificação do teste deve ser entre 10 a 15 segundos [32].

A Figura abaixo ilustra o processo do teste do CMT.

Figura 4 - Ilustração do teste do CMT. Proporção do reagente na escala de 1:1 com leite. Fonte: (infovets.com)
Espectroscopia de Impedância Elétrica - EIE, EBE ou EIS

A técnica também conhecida como bioimpedância elétrica, ainda EIE, EBE ou EIS é um método para caracterização da constituição de elementos biológicos, os quais incluem o percentual de gordura, células, tecidos e alguns tipos de fluidos [34] [35] [36]. As propriedades elétricas de materiais biológicos estão presentes na literatura científica desde 1871 [37]. As aplicações vão desde a separação no espectro de fluido intracelular e extracelular, composição corporal e estudos mais recentes na aplicação de alimentos, água e leite [38] [39] [40] [41] [34] .

Basicamente, a técnica consiste em fazer fluir sobre o material biológico um conjunto de sinais elétricos de múltiplos comprimentos de onda [42]. Alguns constituintes vão apresentar diferentes excitações para cada região de frequência aplicada [34] [43]. Deste modo, é possível até mesmo aplicar o princípio de citometria de fluxo para contagem de células e identificação de partículas [44] [45] [46].

A animação abaixo (Fig. 5) feita pelo Instituto Tecnológico Federal de Zurich na Suíça, ilustra como a técnica de EIS pode ser aplicada para análise de partículas. O artigo publicado na revista Nature que apresenta mais detalhes sobre a aplicação do método está disponível neste link. [50]

eis-particle-bionexus-zurich
Figura 5 - Passagem de uma partícula através de dois pares de eletrodos opostos e a construção do sinal de impedância diferencial. Fonte: (Eidgenössische Technische Hochschule Zürich)

A Figura 6 ilustra o fluxo de corrente elétrica em diferentes frequências por uma matriz biológica complexa constituída de elementos celulares, tal como o leite de vaca.

Figura 6 – Em azul o fluxo dos sinais em diferentes frequências através da solução biológica. Baixa frequência (a), média frequência (b) e alta frequência (c). Fonte: (Veiga, E. A., 2013) [34]

Conforme ilustra a Figura 6, a membrana de elementos celulares apresenta resposta em frequência diferente dos demais constituintes [35]. Neste sentido, é possível obter informações sobre a quantidade de membranas celulares presentes numa solução biológica, como estimar a contagem de células somáticas no leite bovino, por exemplo.

Na análise do leite de vaca, o sistema de medição por EIE, em contato com o leite que deve estar corretamente homogeneizado, faz excitação da amostra por um conjunto de espectros em diferentes comprimentos de onda. Ao atravessar o leite, os sinais sofrem alterações que são detectadas por sensores.

Tais alterações no espectro após contato com a amostra de leite são em função dos seus constituintes, das variações de composição e também pelo conjunto de elementos celulares presentes na amostra em função da mastite [47]. Assim, através de modelagem matemática e inteligência artificial, as distorções nos sinais de resposta são convertidas em informações sobre a presença de mastite.

Como o leite é uma matriz altamente complexa e ainda sujeita a diferentes raças, sistemas de produção, clima, nutrição, entre outros, o sistema é calibrado continuamente tendo como base a oficial contagem microscópica e também os equipamentos de citometria de fluxo existentes no mercado. Entretanto, o software pode ser calibrando para incluir outras variáveis de modo a aumentar a sensibilidade para detecção de mastite, evitando emitir alerta de mastite em vacas sadias.

Figura 6 - Ilustração da aplicação da técnica de EIE para análise do leite bovino cru refrigerado. Fonte: (Milkspec, 2018)

Embora a Espectroscopia de Impedância Elétrica ultrapasse os 100 anos de investigação científica, sua aplicação em alimentos e leite é recente [48]. Assim, nos últimos 10 anos é crescente o número de estudos, trabalhos acadêmicos e práticos da técnica na avaliação de mastite no leite bovino como uma alternativa de baixo custo, de simples aplicação e não requerendo insumos para o processo de análise [49].

No Brasil, o primeiro dispositivo a aplicar a técnica para análise de leite cru refrigerado é o Milkspec®. Trata-se de um dispositivo portátil, prático e que faz teste da amostra em até 1 minuto, podendo ser utilizado direto na fazenda, no laboratório ou na indústria. A tecnologia consegue indicar a presença de mastite no leite por medição indireta da CCS, pois não faz contagem individual de cada célula, mas é sensível à presença de membranas celulares no leite. A presença e aumento da contagem bacteriana, oriunda de possível contaminação na coleta podem interferir no resultado. Por isso, para o correto funcionamento é imprescindível total higiene na coleta, utilizar coletores na ordenha e refrigerar a amostra abaixo de 6°C nos primeiros instantes após o armazenamento da amostra.

Naturalmente, novas tecnologias necessitam de alguns anos para amadurecimento e expansão de mercado, o que gradualmente vem acontecendo com o Milkspec®, hoje presente em vários estados do Brasil e oferecendo informações rápidas de qualidade a mais de 1.400 fazendas produtoras de leite via consultores técnicos, cooperativas e laticínios.

Além disso, o Milkspec® é um produto pesquisado e desenvolvido no Brasil, que conta com apoio de instituições públicas e privadas importantes. É um pequeno passo no avanço tecnológico do país, trazendo independência tecnológica e valorização da inovação nacional.

Referências

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Emiliano Veiga

Engenheiro de Computação e mestre em Engenharia Elétrica na área de concentração sistemas eletrônicos e instrumentação. Filósofo, professor e pesquisador, atua há mais de 10 anos em pesquisa, desenvolvimento e inovação em software e hardware aplicados nos segmentos agro e biomédico. É um entusiasta com inovação tecnológica aplicada na solução de problemas reais e complexos. Nas horas vagas pratica corrida e montain bike, gosta de música e filosofia clássica, tocar violão e estudar mitologia.

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